間に合った！

　最低限必要な５系統から葉緑体とり終了しました。−80℃のフリーザーに、すべてのサンプルがそろったときの開放感は乾杯に値します！

　そもそもは、葉緑体ゲノムDNAの配列を読みたいから始めた葉緑体精製。

　細胞丸ごと、核もミトコンドリアも葉緑体も含めて総ゲノムを精製して配列を読んでも、当然葉緑体ゲノムの配列を知ることはできるはず。ですが、いまのところ、ヘテロシグマ葉緑体ゲノムの大きさは、核ゲノムの１万分の１ぐらいと見積もっています。ゲノムの分子数としては、十倍から1000倍ぐらいあるらしいのですが…。となると、次世代シーケンス技術を使って総ゲノムを読むことで葉緑体ゲノム全長をきれいにつなげるには、かなりのリード数が必要です。５系統、できれば６系統読もうとすれば、弱小ラボにはあり得ないような莫大な費用がかかってしまう。

　となると、葉緑体だけとってきて、その中からDNAを精製するのが現実的。

　というわけで、まず葉緑体をとって、とれてきたものからDNAを精製する、という操作を繰り返してきた訳です。ヘテロシグマ葉緑体DNA量は、当然といえば当然ですが、ヘテロシグマが持っている総ゲノム量のほんの一部。がんばって大容量の培養で増やしたヘテロシグマを出発材料としても、そこからとってきた葉緑体から精製したDNAは、心細いほど、ほんのぽっちり。エタノール沈殿して、目で見えるか見えないか…。というわけで、一日の実験の終わりに、必死に目を凝らして、エタ沈DNAのありかをチューブの底に探す毎日。
　分子生物学かじったことがある人だったら、誰でも味わったことがある切ない気分満喫です。

　この系統からもう少しDNAがあってもいいな、というものもありはするのですが、とりあえず最低必要量は確保できて、大分気が楽になりました。
　というのも、実は、この実験にはゆるいながらも締め切りがあったんです。

　6月29日、つまり２日後、今度の日曜日。いやはや（笑。
　

３度目の田植えの季節

　今週も葉緑体との格闘は続き……ゴールが見えて参りました。
　葉緑体を無傷でとってくる、という操作は、イメージとしては、葉緑体回収バッファーの中でぴりっと一部分だけ細胞を破いてやると、パラパラッと傷のない丸ごとの葉緑体が細胞の外に出てくる。そして、それを密度勾配遠心にかけて、壊れた細胞核とか、別の細胞内小器官とか、細胞壁・細胞膜のかけらとかにくらべて、密度が重い葉緑体だけとってくる、という操作です。
　現在、私たちがもっているヘテロシグマは６系統。このうち５系統から、それぞれの葉緑体をとってきたい。
　と思っていたけれど、５系統それぞれの細胞壁だか膜だかの強度がかなり違ったため、それぞれについて条件検討。全く壊れなければどうしようもないし、もろい細胞に強い条件を使うと、葉緑体にまで傷がついてしまうのです。
　さらに、密度勾配遠心法による分画のステップで、なんと、葉緑体の密度が系統によって結構違うことに気がついて、密度勾配に用いるパーコール密度を検討して……やっとこさ、葉緑体を３系統からとって来れました。
　あと２系統も何とかなりそうな気分になってきました。こうなったら、土日も使ってもうひと頑張り。やれやれ、ここまで３週間かかりました！

　などと実験室内は牛歩の歩みの毎日ですが、窓の外を眺めれば季節はちゃんと移り変わっています。ほ場は大麦の刈り取りも終わって、田植えの季節。

　この研究所に着任するまで、田んぼが広がっている地域に住んだことがなかったのですが、苗が植わったばかりの田んぼの水面って、空が映るんですね。
　ここにやってきて３度目の梅雨ですが、ちょっと感動します。
　

葉緑体バナシその後

　葉緑体をたくさんとりたい！と条件設定に明け暮れた、という話を２週間前に書きました。

　一番問題だったのは、細胞の壊し方・・・・・ちゃんと壊さないと当然葉緑体は取り出せないし、しかし壊しすぎると、葉緑体にまで傷がつく。
　程よいところで無傷の葉緑体をたくさんとってくる条件を探して四苦八苦した訳です。　で、とりあえず、条件設定終了、めでたしめでたし、と思ったのですが。

　今、私たちの手元には、ヘテロシグマ６系統があります。で、これらすべてから大量の葉緑体をとってこなければならない。この６系統、少しずつウイルス感染に対する反応が違ったり、大きさが違ったり、増殖速度も違う・・・・という、それぞれ固有の『性格』があるのですが、しかし、ヘテロシグマはヘテロシグマ。
　１系統で確立した方法は、ほかの系統でも使えるでしょう。

　と思ったところが、甘かった……。
　系統１で方法を確立し、では、と、系統２でその方法を使ってみたら、何と、細胞がどうしても壊れない！では、系統３では、と試してみたら、系統１で踏んだ手順の半分以下で粉々………。

　こんなにヘテロシグマの『丈夫さ』にちがいがあるとは。

　とはいえ、たぶん、生物ってこういうもので、同じ種でも、系統の違いで思わぬところにはっきりとバリエーションがあったりするのでしょうね。

　一応生物学をながいことやってきて、『するのでしょうね』って、ずいぶん頼りない話ですが、この辺が、『モデル生物』に甘やかされてきた研究者の弱点といえます。
　細胞を壊してしまったら後は同じ扱いができる訳ですから、細胞の壊し方については、１系統ずつじっくり決めていこうと思います。

　６月終わりまでには、しゃきっと終了したいものです。

梅雨入り

　九州は梅雨入りしましたね。

　晴れの国、と言われるだけあって、岡山は確かに梅雨でも雨の日が少ないです。
とはいえ、中国山地にはしっかり降っているものらしく、１級河川３本に恵まれた岡山や倉敷は、水不足になりにくいとのこと。

　という、大変にありがたい立地ではありますが、やはり梅雨時、湿度が高くなります。
　湿度が高くなると空気中のカビや酵母などが多くなり、無菌培養にもこれらが混入する確率が多くなります。というわけで、いわゆる『コンタミ』が問題になるのもこの季節。さいわいなことに、私たちが研究しているヘテロシグマは、独立栄養藻。人工海水という、つまり、糖などのエネルギー源がない培地で光合成をして育つため、ほかの従属栄養細菌などが混入しても育ちにくく、培養はかなり簡単です。
　対して、やはり独立栄養なはずの高等植物ですが、これらは培地に結構な濃度の糖やビタミンを加えます。植物の無菌培養をしている人に言わせると、雨が降った次の日にあけたサンプルは、カビなどが混入する率が高いそう。神経を使う季節です。
　
　培養については毎年の話なのですが、最近、やってみたいと思った実験があり、その方法を用いて研究している方にお便りを差し上げて、いろいろ教えていただきました。すると、お返事に、『これからの季節のように湿度が５０％を超える日が続くとてきめんに難しくなります』とあり、あら、そんな落とし穴があったとは。

　今日は、特に雨が降っているのですが、こういう日はなるべく避けた方が良さそうです。

　ところで、梅雨入りしたのに、研究所の圃場はまだ乾いた土のまま。田植えも始まっていません。今年の梅雨入りって、例年よりも早かったのでしょうか・・・・？

　
　

葉緑体で悪戦苦闘

　今週は、ヘテロシグマの葉緑体の分離に明け暮れました。
　細胞内小器官である葉緑体を取ってくるには、細胞を適切な溶液中で細胞膜だけをこわすような穏やかな条件で破砕し、中の葉緑体を密度勾配遠心を使ってとってくる、という手順を踏みます。顕微鏡で見たら、見かけは丸ごとの葉緑体でも、破損していると密度が小さくなる。密度勾配遠心で、沈んでくる葉緑体だけが無傷の葉緑体なのだそうです。

　とくに生化学的な実験をするために大量に必要な場合、葉緑体の精製元としては、ほうれん草がよく使われていました。他にも、モデル植物のナズナとか、モデル藻類のクラミドモナスなどから、葉緑体を壊さずにとってくる方法が確立されています。
　使うバッファーはほとんど同じ。ということは、葉緑体としての性質は、種が違っていても似通っているわけで。
　それでは、ヘテロシグマからだって同じ方法でとってこれるでしょう。

　と、おもったのですが、これが思ったよりも難しかった。
　ほんの少しをきれいに獲ってくることはできていたのですが、今度の実験には、大量に無傷かつ純度が高いものを取ってきたい。
　何が難しいかというと、収量を上げようと、細胞を完全に壊してしまおうとすると、細胞から外に出てきた葉緑体にも傷がつきがち。
　しかし、葉緑体にやさしい条件をと考えて、細胞の破砕条件を甘くすると、細胞が壊れなくて、そもそも葉緑体を取り出せない。

　こういうものって、そもそもの破砕強度を調節するか、あるいは繰り返す回数を増やしてみたり減らしてみたり、微妙かつ再現可能な方法で手加減するしかないんですよね。

　結構苦手なタイプの実験かも・・・・・・(笑)

　とはいえ、ああでもないこうでもないと奮闘した甲斐あり、きれいな葉緑体がたくさん取れてきました！これからしばらくは、大量培養⇒大量精製を繰り返すことになりそうです。

初めての打ち合わせ

　今年の4月から、共同研究を始めました。
　今週は、そのためのパートナーお二人と、打ち合わせ・情報交換。
せっかくだから、顔を合わせて、ということで、地理的には真ん中に位置する、私どもの研究所にお二人にお越しいただいて、これからやらなければならないことを話し合いました。

　うちお一人には、セミナーもしていただいて、とても実りの多い2日間でした。

　セミナーをしていただいた方とは、実は、10年前、私が留学していた研究室を訪ねてくださったのが最初のきっかけで知り合いました。
　ほんの少しのきっかけで、10年後の今、共同研究者になっていただいたわけで、出会い、だの、めぐりあわせ、の貴さがわかります。

　広いようで狭い業界、同僚の一人が、このかたと学生時代から仲の良い友達だったりして、夜、皆でご飯を食べに行ったり、楽しい2日間でした。

　それにしても、さて、数理解析。頼りになる共同研究者と手を組めたからといって、何も考えず、丸投げというわけにはいかないので、今年の初めから少しずつ始めていた解析の勉強も、実地のデータ解析にまでつなげていかなければなりません。
　もちろん、解析に必要なデータを取るのが先決で、そのためには完了しなければならない下準備もいろいろ・・・・。

　研究は3年間の計画ですが、よりよい結果を出すためにも、気を引き締めていかなければ、と今更ながら考えた一週間でした。

なんて言っているうちに、オオムギが実る季節。もうじき、

オオムギグループ総出での収穫に続き、稲作開始の時期

になります。

よそのグループをのぞいてみると・・・・・

　フローサイトメトリーを使わせていただきたくて、岡大の某先生のラボにお邪魔しました。動物細胞を使っていれば、使う人も多いフローサイトメトリーですが、当研究所は、植物に特化しているため、フローサイトメトリーを持っていない・・・・・。
というわけで、アイスボックスにサンプルを詰めて伺いました。

　肝心の実験は、はてな？な結果が出てきたのと、サンプルの調製の仕方に改善の余地あり、というのがわかって一日が終わってしまいましたが、これは、『非モデル生物』を扱うものの宿命。他の生物で確立されたプロトコールを見て、それを応用したので、ヘテロシグマには向かないところがあったのでしょう。改善点いくつかを検討して、再びお邪魔することに。

　という、本来の目的とは別に、他のラボを訪ねていくと、当然ながらラボの設備に目が行きます。
　使いやすそうな、ちょっとした備品の配置を真似したり、『ほっほ～～、こんな機器があるのか』と感心したり、面白いものです。
　お訪ねした先は、着任されて数年たつアクティビティの高いラボですので、機器も新しいものがいろいろ導入されていて、うらやましい限り。
　研究の内容についての夢を持つことはもちろん大切ですが、様々な研究環境を目の前に見ることで、数年後の自分たちの行き着きたいところに思いを致すのも、日々の研究活動に弾みを与えてくれますね。

　それにしても。
　『最初のからっぽから較べたらずいぶん充実したよね』と、現状にちらりと満足を覚えていたのですが、『すでに立ち上げ期を脱して数年、順調に水平飛行中・実績蓄積中』というラボに行くと、まだまだ！！というのがよくわかります。

　お訪ねしたラボには、なんと「全自動ブロッター」などというものががありました！バッファーだの、抗体だの、必要なものをセットしておけば、全自動洗濯乾燥機みたいに、ウエスタンブロッティングのすべてのステップを自動でやってくれる、というものだそうです。
　最適化がむずかしいようですが、確かに、全自動がうまく動けば、再現性の良い実験が可能になりますよね。
　こういうのって、製薬会社などが人件費削減のために導入するようなイメージがあったのですが、むむ、大学でも導入するんだぁ。

　と、びっくり仰天しながら帰ってきて、煽られて実験用アイスバケツを購入。
　ただでもらえる発泡スチロールのクール宅急便用保冷箱をつかっているのですが、実験室用のアイスボックスのほうがはるかに保冷効果が高いのです。
　前からほしかったのでかっちゃった。
　理化学製品のディスカウントのサイトで掘り出し物を見つけて一万円足らずぐらい。
　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・なんてささやかなんだろう(笑)。